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新聞動態(tài)
分享一下酵母感受態(tài)細胞的制備方法
   酵母,如釀酒酵母、裂殖酵母和畢赤酵母,通常用于生物學(xué)實驗研究。酵母是易于培養(yǎng)的單細胞真核生物,他們的基因和蛋白質(zhì)與哺乳動物具有很好的相似性,所以是的生物模型。酵母細胞用于研究基因功能,蛋白質(zhì)相互作用,細胞通路等,也是大規(guī)模異源蛋白表達和小分子生產(chǎn)的宿主,在發(fā)酵,釀造和制藥行業(yè)等起著*的作用。涉及酵母的常見的實驗有酵母雙/三雜交系統(tǒng),突變體篩選庫和同源重組,等等。

  一、為什么我們需要酵母感受態(tài)細胞?

  通常,在實驗過程中需外源DNA引入到酵母細胞。引入基因片段(線性ssDNA或質(zhì)粒)是通過酵母細胞的轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)的,具體方法有化學(xué)法,如醋酸鋰和聚乙二醇(PEG)或電穿孔法。有效的酵母轉(zhuǎn)化需要高質(zhì)量的酵母感受態(tài)細胞為開始。勝任力則是指細胞能吸收游離的細胞外的遺傳物質(zhì)(如質(zhì)粒DNA)的能力。

  二、酵母感受態(tài)細胞的制備獲得感受態(tài)細胞相當(dāng)簡單,但許多研究人員在實現(xiàn)良好的生存比例和轉(zhuǎn)換效率時 遇到問題。常見的誤區(qū)包括由于制備條件惡劣導(dǎo)致高的細胞死亡率,或由于無效的感受態(tài)細胞制備導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率低。雖然酵母細胞和大腸桿菌一樣容易生長和轉(zhuǎn)化,但它們需要不同的處理方法來制備感受態(tài)細胞和轉(zhuǎn)化。酵母細胞像哺乳動物細胞一樣,有類似的處理程序。典型的酵母感受態(tài)細胞制備方法如下:

  1.過夜培養(yǎng)你想轉(zhuǎn)化的酵母菌菌株,使用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基培養(yǎng)不含質(zhì)粒的細胞。

  2.對于已經(jīng)含有質(zhì)粒的細胞,使用適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基來維持質(zhì)粒。

  3.當(dāng)細胞密度達到1 - 2 x 107cells/mL,離心收獲細胞。細胞密度可以通過使用分光光度計在OD600檢測,或者使用血球計在顯微鏡下計數(shù)細胞。

  4.沖洗細胞,重懸于無菌水,離心,棄上清,重復(fù)此步驟兩次以*清洗細胞。zui后一次洗完,將細胞重懸于感受態(tài)細胞溶液,分裝,大約每管108個細胞,每個轉(zhuǎn)化反應(yīng)將使用這些數(shù)量的細胞。

  5.分裝好的管子放于-80°C,供以后實驗使用。在所有步驟中,使用質(zhì)量好的無菌過濾器消毒過的試劑,以防止污染問題。

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